荧光定量数据有效性分析

判断荧光定量数据的有效性，可以结合扩增曲线，溶解曲线，标准曲线以及NTC（检验引物）和NRC（检验模板）来分析。

扩增曲线应呈现出平滑的S型曲线，起始无扩增，起峰时间正常，由扩增曲线得到的Ct值是判断实验成功与否的重要参考，Ct值有一定的可信范围，临床检验小于33，科学研究小于38，内参基因一般小于20，且样品间内参的Ct值差不超过1，表明内参基因表达量稳定，复孔Ct值标准偏差不超过0.5；

溶解曲线应呈现单峰，峰的宽度较小，NTC和NRC无特异的峰出现；

标准曲线的斜率范围-3.58~-3.10，对应引物的扩增效率范围90%~110%，R2代表线性拟合度，一般大于0.95；

NTC用于判断反应是否存在模板污染，引物是否特异，是否会形成引物二聚体。NTC最佳状况是没有扩增，即扩增曲线和溶解曲线与基线重合，没有Ct值。NTC有扩增的情况下，至少与加入模板体系的Ct值相差5或10以上；

NRC用于判断cDNA模板中是否存在基因组DNA残留，可以间接反映RNA中基因组DNA污染情况，理想情况下，NRC没有Ct值，有Ct值的话至少要跟加入cDNA模板体系的Ct值相差5或10以上。荧光定量标准数据参考范围见下表格：

荧光定量常见问题解析

1. Ct值出现过晚（＞38）：

a. 扩增效率低 ，反应条件不够优化，可以重新设计引物或探针、更换灵敏度更高的试剂、改用三步法反应，降低退火温度；

b. 反应成分降解或模板量偏低，可以设置阳性对照、检查RNA质量、提高反转录效率、采用一步法qRT-PCR；

c. PCR产物太长，可以重新设计引物，扩增长度建议100-200 bp。

2. 无Ct值或无信号：

a. 循环数偏少，建议扩增循环数35以上，可以根据具体情况增加循环数至45；

b. 信号采集设置有误，三步法建议在72℃延伸采集，确定设置了采集信号指令；

c. 引物或探针失效，建议设置阳性对照、探针退火温度偏低，凝胶电泳检测是否存在扩增产物；

d. 模板不足或降解，建议检测RNA质量、提高反转录效率、避免cDNA反复冻融、使用探针法；

e. 阈值设置不正确，阈值建议在指数期进行手动调整。

3.  扩增曲线S型异常（图一）：

a. ROX添加不当，建议根据机型选择合适的ROX；

b. 模板浓度过高，可以适当稀释模板，减少扩增抑制；

c. 基线设置不正确，基线期起始于3-10个循环，终止于指数扩增前，有些机型可以手动调整。

图一

4. 扩增曲线平台期不平滑（图二）：

a. 探针或荧光染料品质不好；

b. 仪器使用过度，荧光收集不稳定；

c. 仪器未经过校正（包括自动校正或ROX校正)；

d. 体系中抑制物较多，导致荧光不稳定。

图二

模板中抑制物包括多糖类，有机溶剂，蛋白酶K等，可以参考之前给大家介绍的RNA品质检测内容。一般cDNA中存在抑制物可以在反转录前对RNA进行梯度稀释，分别进行反转录，可以减少或消除抑制物的影响（参见图三）。

图三

5. 扩增精密度差（图四）：

a. 加样误差，建议引物和qPCR Mix先预混，分装后加模板；

b. 体系配置错误，仔细检查操作步骤；

c. 反应液没有混匀，充分涡旋混匀；

d. 低拷贝基因或模板浓度过高或过低，调整模板上样量，cDNA原液加入体积不超过体系总体积1/10；

e. 未引入校正系统，根据机器型号加入ROX。

图四

6. 溶解曲线不是单峰（图五）：

a. 引物设计及用量问题，建议重新设计退火温度较高（58~62℃），无错配，Blast比对特异的引物、引物用量合适（0.2~0.4 μM）；

b. 模板有基因组污染，建议优化RNA提取方法，选择合适的反转录试剂，跨内含子设计引物；

c. 基因表达量低，建议增加反转录效率，适当提高模板量，选用一步法qRT-PCR；

d. 扩增体系不佳，可以使用灵敏度高，特异性强，封闭技术先进的试剂。

图五

7.  标准曲线线性关系不佳（图六）：

a. 加样误差，建议标准品加样体积大于2微升、引物预混后再分复孔，定期校正移液器，尽量选择硅化枪头，使用文库稀释液稀释标准品，降低耗材管壁对DNA吸附；

b. 标准品降解，应该避免反复冻融、电泳检测发现降解后重新制备稀释标准品；

c. 模板浓度高或有抑制物，可以改变稀释精度，增加稀释梯度；

d. 引物或探针不佳，重新设计引物和探针； 

e. PCR酶灵敏度不高及活力下降，建议更换灵敏度更高，线性关系更好的试剂，校正-20℃冰箱，使用时将酶置于冰上。

图六

8. NTC有扩增：

a. 水，试剂或引物污染，可以分装水和引物，试剂优先于引物和模板加入到体系中；

b. 引物二聚体，建议优化引物设计，提高退火温度（58~62℃），降低引物浓度（0.2~0.4 μM）；

c. PCR核心酶特异性差，可以选用封闭技术先进（全封闭）的试剂。

9. 扩增效率低：

a. 反应条件不够优化，建议降低退火温度，使用三步法，使用扩增更线性的试剂；

b. PCR抑制物，建议优化核酸纯化方法，适当稀释模板降低抑制物影响；

c. 引物设计，引物避免3’端错配、扩增片段长度在100~200 bp 。

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