1.     转膜失败

观察预染Marker，没有Marker条带（一条都看不到）可能的原因：

①考虑电极是否插反，若是，需要重新进行电泳及转膜；

②使用的是PVDF膜，要考虑转膜前是否使用无水甲醇进行了活化。

转膜不充分（小条带在膜上，大条带在胶上）的可能原因有：

①转膜时间过短，需适当延长转膜时间；

②出现不均匀转膜，表示膜没有经过充分的浸润平衡，需要延长膜在转膜缓冲液中的平衡时间。

过转（大条带在膜上，小条带消失）的可能原因：

①转膜电压太高或时间过长，减低电压，减少转膜时间；

②膜的孔径不合适，要根据蛋白大小选择合适孔径的膜（0.2 μm或更小）；

③蛋白与膜的结合不强，可以选择结合能力更强的PVDF膜

2.     没有信号或信号很弱

这一问题要分为两种情况：一种是上面提到的转膜失败，建议使用丽春红染色或预染Marker，来监测转膜状态。

另一种是无目的条带或条带很弱，可能原因有多种：

①蛋白上样量过低，需要增加上样量；

②抗体效价、浓度低，需要增加抗体浓度或延长孵育时间；

③抗体失效，这种常见于反复冻融导致的失效，需要更换或补加新的抗体；

④ECL显色液失效，ECL显色液需要现用现配；

⑤蛋白制备过程中降解或储存不当导致降解，重新制备样品；

⑥抗体浓度过高，导致底物迅速被消耗，在膜上可以看到淡黄色或浅褐色条带，需要对抗体进行一定程度的稀释。

3.     背景过高

上面两张图片的背景很高，而且可以看出有非特异性条带，出现这种情况首先考虑是否为封闭不彻底，建议延长封闭时间（4℃晃动过夜）、增加封闭蛋白（如BSA、脱脂奶）的浓度、更换封闭液种类（将脱脂奶更换成BSA）等。其次考虑是否为洗膜不彻底，建议少量多次洗涤，一般条件为洗3次，每次洗涤10分钟，背景过高或有非特异性杂带时，可以考虑将洗膜缓冲液少加一些，洗膜次数增加成5次甚至更多，每次洗涤5分钟；也可以适当增加去垢剂的强度，如将Tween-20换成NP-40。另外，也可能由于抗体浓度过高或蛋白上样量过高导致，建议适当增加抗体的稀释倍数（主要为一抗），降低蛋白上样量。

4.     反影或空斑

如左图所示，反影或发现膜上的条带为黄色，说明蛋白上样量过高，或抗体浓度过高，需适当减少上样量或增加抗体稀释倍数。

右图中显色条带有白色未显影空斑，可能是膜未充分浸润平衡，用缓冲液或甲醇充分浸润膜；也可能是转膜时膜与胶之间有气泡，或显色后包保鲜膜时有气泡，需要仔细操作，赶走气泡，然后再进行下面的操作。

5.     微笑或皱眉条带

左图为微笑条带，可能的原因有：

①条带迁移过快或电泳温度过高，建议降低电压，缓慢电泳，如有需要可进行低温电泳；

②凝胶中间凝固不均匀（多见于厚胶），建议配胶后放置足够长的时间，待凝胶充分凝固后再进行电泳。

右图为皱眉条带，可能由凝胶与玻璃挡板底部的气泡导致，在上样之前可使用大量程移液枪反复吹打以排除气泡。

6.     条带扭曲

上图中的情况也比较常见，可能原因有两点：

①分离胶与浓缩胶界面不平，可以使用异丙醇或乙醇来进行封胶，之后需要用水进行润洗，另外做好分离胶后要注意立即封胶；

②蛋白溶解度不好或体系中盐离子浓度过高，上样前可以将蛋白进行离心，以去除析出颗粒的影响，另外需要优化蛋白提取方法，寻找更合适的裂解液。

7.     条带太宽或太粗

左图的条带太宽，可能是样品中盐离子浓度过高，需要调整裂解液的组成；也可能由于样品上样体积过大，电泳过程中样品向旁边泳道扩散，建议将所有泳道的上样体积调成一致。

右图的条带比较粗，可能是浓缩胶没有发挥作用，建议检测试剂的pH值，重新配制浓缩胶，另外可以适当增加浓缩胶的长度，尽量低电压进行电泳。

8.     斑点、纹理或拖尾

左图中有很多斑点，这个说明封闭液有杂质，在配制脱脂奶之后最好静置一段时间，使较大的颗粒沉淀下来。

中间的图片显示有垂直纹理，可能是样品中有不溶性颗粒，需要优化蛋白提取方法，寻找更合适的裂解液，上样前最好进行离心；还可能因为凝胶中有小气泡，在配胶时要注意观察并赶走气泡。

右图显示为拖尾，可能是蛋白样品溶解度不好，需要优化蛋白提取方法，寻找合适的裂解液，或者加样前进行离心；可能因为电泳缓冲液重复使用次数过多，需要更换新鲜的电泳缓冲液；也可能是因为分离胶浓度过大，需要降低凝胶浓度。

9.     其它问题

显色后目的蛋白分子量同预期不一致，可能原因有：

①蛋白翻译后修饰的影响，比如糖基化、磷酸化、羟基化修饰，都会影响到蛋白的实际大小。

②蛋白由特殊氨基酸组成，含有较多碱性氨基酸会使迁移率降低，如溶菌酶；含有较多酸性氨基酸会使迁移率增加。

③蛋白上样量太多，有可能导致条带下移，需要减少上样量判断准确位置。

电泳染色后加样孔底部或浓缩胶与分离胶界面处有条带，这种情况多发生于大分子量蛋白分析中，由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠或亚基重新聚合形成大分子，不能进入分离胶。解决办法有：加热煮沸样品后，添加适量的DTT或β-ME，以补充不足的还原剂；也可以在煮样时添加适量EDTA，以阻止还原剂的氧化。

当需要使用不同抗体对同一张膜进行杂交时，需要做Strip处理。Stripping Buffer的配方：100 mM 2-ME+2% SDS+62.5 mM Tris (pH 6.7)，建议现用现配。将膜放置于Stripping Buffer中，55℃孵育30 min。之后使用TBS或TBST进行洗涤，并重新进行封闭、抗体孵育、显色等步骤。

整个 Western Blot 技术流程及可能出现的问题解析就给大家介绍到这里，那么如何保证WB的成功呢？

Western Blot 实验注意事项

①首先蛋白制备是关键，要注意冰上裂解，全程在低温下进行。

②凝胶的配制不可小觑，凝胶时间要足够长，以保证充分交联，也可放置于4℃进行交联。

③蛋白上样前，建议使用电泳缓冲液清洗梳孔，以去除气泡和碎胶，防止出现条带扭曲现象。

④上样时建议各泳道中蛋白样品的上样体积保持一致，可以使用1×Loading Buffer将上样体积调成一致。

⑤如果条件允许，可以低电压跑浓缩胶，再调高电压跑分离胶。封闭和洗膜一定要充分，以减少非特异性条带及背景。

⑥一抗和二抗的浓度要进行优化，浓度过高或过低都无法得到好的条带。科学的设置阳性对照和阴性对照，以监测整个过程。

Western Blot 整体流程及相关产品

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