我们知道，CUT&Tag和CUT&RUN技术都是Steven Henikoff开发的，2017年先发表了CUT&RUN，使用pA-MNase切割目标蛋白结合的DNA，得到的DNA需要进行末端修复加A加接头的过程。2019年发表的CUT&Tag中使用pA-Tn5转座子，切割后得到的DNA就已经添加了测序接头，大幅简化了操作步骤，因此更受到大家青睐。

 那么为什么CUT&Tag没有完全取代CUT&RUN呢？除了建库流程的区别，其更深层次的原因是什么？接下来我们一起看看其在应用场景上的两个主要区别。

区别一：异染色质组蛋白修饰的适用性

 先试想一下CUT&Tag与ATAC-seq的区别，两者都是使用Tn5酶切割染色质，核心区别在于是否使用了抗体富集。ATAC-seq中Tn5酶只切割开放的染色质，对处于关闭状态的异染色质区则不能进行切割，这也是做ATAC-seq的目的。那么如果要做异染色质组蛋白标记H3K9me3的分布位点，使用CUT&Tag合适吗？Tn5酶不是切割不了异染色质区吗？

图1. 异染色质区组蛋白H3K9me2/3修饰^[1]

 从小编得到的信息来看，有一些老师使用CUT&Tag也能做出H3K9me3的位点，这其实是因为H3K9me3不是只分布在关闭区，有些将要关闭但还处在开放状态的染色质也可能会有H3K9me3的分布，再加上抗体介导的Tn5富集，关闭的区域也会有DNA能被转座到。

 虽然如此，H3K9me3这种异染色质区域的组蛋白标记其实更适合用CUT&RUN，因为MNase酶的分子量更小，位阻更小，相比Tn5，能够更好的切割异染色质区的DNA，这也是为什么很多高分文章中H3K9me3的位点是用的CUT&RUN，这是其与CUT&Tag应用场景的第一个区别。

图2. CUT&RUN绘制人类早期胚胎发育过程中的H3K9me3位点^[2]

图3. CUT&RUN检测斑马鱼胚胎发育过程中的H3K9me3位点[^3]

区别二: 转录因子结合位点的分辨率

 那么第二个区别是什么呢？答案是对于转录因子，CUT&RUN得到的结合位点具有更高的分辨率，尤其是先锋转录因子（pioneer transcription factors），一类能够直接与封闭染色质（缠绕在核小体上的DNA序列）结合并打开紧密的染色质结构的转录因子，进而增加染色质可及性并促进其它转录因子的结合，在早期启动基因转录过程中发挥重要作用。

 Henikoff的原话：We prefer CUT&Tag for histone modifications as it does not require making sequencing libraries. However, we prefer CUT&RUN for transcription factors, as it provides base-pair resolution, which we have found very useful in our recent study of pioneer transcription factors (Meers et al. "Pioneer Factor-Nucleosome Binding Events during Differentiation Are Motif Encoded" Mol Cell. 2019 Jun 10.

图4. CUT&RUN绘制先锋转录因子结合位点^[4]

 简单来说，CUT&RUN切割转录因子结合位点得到的片段范围更小，切割两端与结合位点中心更近，也就是碱基分辨率更高。当已经有目标基因时，可以通过设计引物进行qPCR定量分析目标蛋白的结合丰度在不同样本间的变化，这里以传统的ChIP-qPCR作为对比，文献中直接展示出了CUT&RUN-qPCR具有更好的富集和更高的分辨率^[5]。

图5. 与ChIP-qPCR相比，CUT&RUN-qPCR具有更好的富集^[5]

图6. 与ChIP-qPCR相比，CUT&RUN-qPCR具有更高的碱基分辨率^[5]

 总结一下，CUT&Tag的实验流程更简单，所需的细胞量可以比CUT&RUN更低，CUT&Tag适用于大多数非异染色质组蛋白的研究，也适用于多数转录因子的研究，其应用场景更广。而CUT&RUN更适用于异染色质区的组蛋白标记（H3K9me2/3）和先锋转录因子的研究。另外，由于对转录因子的分辨率更高，CUT&RUN-qPCR是传统ChIP-qPCR的理想替代者。

 最后解释一个误区，有的老师可能会认为CUT&RUN对转录因子的成功率更高，实则不然。当一个常规的转录因子使用CUT&Tag建库失败时，排除操作的影响，那么再使用CUT&RUN大概率也不会成功，这种情况下，建议交联后再尝试或考虑更换抗体。实际上，针对转录因子通常会优先采用交联的方式，毕竟很多转录因子与DNA的结合并不是很牢固。

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参考文献：

[1] Haws, et al. 3D genome, on repeat: Higher-order folding principles of the heterochromatinized repetitive genome. Cell. 2022 Jul 21;185(15):2690-2707.

[2] Xu, et al. Stage-specific H3K9me3 occupancy ensures retrotransposon silencing in human pre-implantation embryos. Cell Stem Cell. 2022 Jul 7;29(7):1051-1066.e8.

[3] Akdogan-Ozdilek, et al. Identification of chromatin states during zebrafish gastrulation using CUT&RUN and CUT&Tag. Dev Dyn. 2022 Apr;251(4):729-742.

[4] Meers, et al. Pioneer Factor-Nucleosome Binding Events during Differentiation Are Motif Encoded. Mol Cell. 2019 Aug 8;75(3):562-575.e5.

[5] Panday, et al. A modified CUT&RUN-seq technique for qPCR analysis of chromatin-protein interactions. STAR Protoc. 2022 Jul 31;3(3):101529.