转录组测序是一种用于分析细胞中所有RNA分子的高通量测序技术。它可以帮助研究者了解基因表达模式、发现新的转录本、探究基因调控机制等。在进行转录组测序之前，需要从生物样本中提取总RNA，并构建一个包含所有RNA种类的DNA文库。

与我们之前介绍的DNA建库不同，RNA建库的样本处理流程要复杂一些，整体的流程主要包括：RNA提取，mRNA富集，富集后RNA建库以及上机检测和分析。

RNA建库流程

1.     总RNA提取：从样本中提取总RNA，包括mRNA、rRNA、lncRNA等所有RNA种类。

2.     mRNA富集：对于真核生物，可以通过oligo dT磁珠富集mRNA，或者通过去除rRNA的方法来富集目标RNA。

3.     片段化：将富集后的RNA打断成短片段，为后续的cDNA合成做准备。

4.     cDNA第一链合成：使用随机六聚体引物或特异性引物，以RNA为模板合成cDNA的第一链。

5.     cDNA第二链合成：合成cDNA的第二链，并去除原始的RNA模板。

6.     末端修复和加A：修复cDNA的末端，使其成为适合连接接头的结构，并在3'端加上A碱基。

7.     连接接头：将包含测序平台特定序列和样品特异性barcode的接头连接到cDNA上。

8.     PCR富集：通过PCR扩增文库，增加测序时的有效模板数量。

那么我们为什么要在RNA建库前进行mRNA的富集呢？如果不进行会有什么样的影响呢？ 接下来就大家详细介绍下，mRNA富集对RNA建库的意义。

mRNA富集

mRNA富集的意义

1.     测序深度受限：在总RNA中，mRNA通常只占一小部分（例如，在人类细胞中，mRNA可能只占总RNA的1-5%），而大部分是rRNA。如果不富集mRNA，测序时mRNA的信号可能会被rRNA的高丰度背景噪声所淹没，导致测序深度不足。

2.     数据质量下降：由于rRNA和其他非编码RNA的干扰，测序得到的reads可能大部分是rRNA序列，这会降低mRNA相关数据的比例和质量，使得后续的数据分析更加困难。

3.     分析复杂性增加：如果不富集mRNA，需要在后续的数据分析阶段进行额外的步骤来去除或区分rRNA和其他非目标RNA，这会增加分析的复杂性和工作量。

4.     资源浪费：不富集mRNA意味着测序资源（如测序深度和试剂）可能会被浪费在非目标RNA上，导致成本效益比降低。

5.     低表达基因的检测难度增加：在没有富集mRNA的情况下，低丰度的mRNA可能会被高丰度的rRNA掩盖，使得低表达基因的检测变得更加困难。

6.     实验结果的解释困难：由于mRNA和非mRNA 的表达水平和生物学功能差异很大，不进行富集可能导致实验结果的解释变得复杂，难以得到准确的生物学结论。

因此，在大多数情况下，为了提高转录组测序的效率和结果的准确性，建议在RNA建库前进行mRNA富集。这样可以确保测序资源主要集中在目标mRNA上，提高数据的质量和分析的准确性。

图1 总RNA中各种RNA的占比情况

mRNA的富集是非常必要的，那么mRNA的富集方法有哪些呢？这些方法之间有什么区别？

常见的mRNA富集方法

1. Oligo(dT)磁珠富集mRNA

背景：由于真核生物的mRNA具有poly(A)尾，Oligo(dT)磁珠富集方法利用这一特性。

原理：Oligo(dT)序列与mRNA的poly(A)尾通过互补配对结合，然后利用磁珠分离出结合的mRNA。

优点：

●   特异性高，能高效富集mRNA。

●   操作简便，纯化效果好。 

缺点:

●   可能会错过没有poly(A)尾的RNA，如某些lncRNA。

●   富集的mRNA可能包含未成熟的mRNA。 

应用：适用于研究真核生物的mRNA表达。

2. 去除rRNA（如Ribo-Zero，RNase H消化法）

背景：总RNA中rRNA含量很高，去除rRNA可以提高mRNA的测序深度。

原理：使用特定探针吸附rRNA并去除，以此来富集mRNA。

优点：

●   可以富集到非poly(A)尾的mRNA。

●   适用于全转录组测序，包括lncRNA等。 

缺点：

●   可能去除一些低丰度的mRNA。

●   操作相对复杂，成本较高。 

应用：适用于原核生物和真核生物的全转录组测序。

3. 片段化富集

背景：在某些情况下，需要将总RNA片段化后再进行富集。

原理：使用片段化试剂将总RNA打断成小片段，然后通过特定的富集方法提取mRNA。

优点：

●   可以减少RNA降解对测序结果的影响。

●   有助于提高测序的均匀性。 

缺点：

●   片段化过程可能会引入偏差。

●   需要额外的步骤和时间。 

应用：适用于需要片段化RNA的实验设计。

4. 基于大小的富集

背景：mRNA通常比rRNA和tRNA等其他RNA分子大。

原理：通过物理方法（如超速离心、柱层析等）根据大小分离mRNA。

优点:

●   可以去除大部分rRNA，提高mRNA的纯度。

●   操作相对简单。 

缺点：

●   可能会丢失一些较小的mRNA。

●   富集效率可能不如Oligo(dT)磁珠。 

应用：适用于需要初步分离mRNA的实验。

5. 基于捕获的富集

背景：利用特定的捕获技术，如CAPP-seq（Capture Hybridization Analysis of RNA Precipitates）。

原理：使用特定的探针捕获目标mRNA。

优点：

●   可以针对特定的mRNA进行富集，提高测序的针对性。

●   可以用于研究特定类型的mRNA。

缺点：

●   需要预先设计和合成大量的捕获探针。

●   成本和操作复杂度较高。

应用：适用于特定mRNA的研究，如肿瘤标志物等。

每种方法都有其特定的应用场景和优势，研究者需要根据实验目的、样本类型和预算等因素来选择合适的mRNA富集方法。

mRNA富集方法的选择

选择哪种mRNA富集方法通常取决于研究目的、样本类型、预算和实验设计等因素。下面我们就常见的应用场景和该场景下推荐的mRNA富集方法给大家介绍一下：

1. 研究真核生物的mRNA表达

场景：当目标是研究真核生物（如哺乳动物细胞）中的基因表达模式时。

推荐方法：Oligo(dT)磁珠富集。真核生物的mRNA具有poly(A)尾，Oligo(dT)磁珠可以高效地富集mRNA。

2. 全转录组测序

场景：当需要分析包括编码和非编码RNA在内的所有转录本时。

推荐方法：去除rRNA的方法（如Ribo-Zero）。可以去除总RNA中的rRNA，富集mRNA和其他类型的RNA，如lncRNA。

3. 原核生物转录组测序

场景：研究细菌等原核生物的转录组。

推荐方法：去除rRNA的方法。原核生物的mRNA通常不具有poly(A)尾，因此Oligo(dT)富集不适用，需要使用去除rRNA的方法。

4. 低质量或降解的RNA样本

场景：当样本质量较低或存在RNA降解时。

推荐方法：片段化富集。片段化可以减少降解对测序结果的影响，并有助于提高测序的均匀性。

5. 稀有或特定类型的mRNA研究

场景：当研究特定类型的mRNA，如肿瘤标志物或特定细胞类型的标记物时。

推荐方法：基于捕获的富集。这种方法可以使用特定的探针捕获目标mRNA，提高研究的针对性。

6. 预算有限或需要快速操作

场景：在预算有限或需要快速完成mRNA富集时。

推荐方法：基于大小的富集。这种方法相对简单且成本较低，但可能不如其他方法特异性高。

7. 需要高覆盖度和高灵敏度的表达分析

场景：当需要对mRNA表达进行高覆盖度和高灵敏度的分析时。

推荐方法：结合多种富集技术。例如，可以先使用去除rRNA的方法进行初步富集，然后通过Oligo(dT)磁珠进一步富集mRNA。

每种富集方法都有其优势和局限性，因此在选择时需要综合考虑实验的具体需求。有时，为了获得更全面的数据，研究者可能会选择结合使用多种富集方法。

RNA文库构建

在RNA建库中我们还经常听到有链特异性建库和非链特异性建库的方法，这2种方法又有什么不同呢？

链特异性建库（Stranded RNA-seq）

原理：

●   链特异性建库方法能够区分mRNA的编码链（正链）和非编码链（负链）。

●   通常通过在cDNA合成过程中引入特定的引物或使用特定的反转录酶来实现链的区分。

●   在链特异性建库中，正链或负链的信息被保留在最终的测序数据中。

优点：

●   提供关于转录本方向性的信息，有助于更准确地确定基因的表达方向。

●   对于分析基因的可变剪接、融合基因、新转录本的发现等非常有用。

缺点：

●   操作更复杂，需要特定的试剂和步骤来保持链的特异性。

●   成本可能更高。

应用场景：

●   需要精确了解基因表达方向性的转录组分析。

●   研究基因的可变剪接和转录本的多样性。

●   探索未知基因区域和新转录本。

非链特异性建库（Non-stranded RNA-seq）

原理：

●   非链特异性建库不区分mRNA的编码链和非编码链。

●   在cDNA合成过程中，正链和负链被同等对待，最终的测序数据中不包含链的特定信息。

优点：

●   操作相对简单，不需要特定的链特异性引物或酶。

●   成本相对较低。

缺点：

●   不能提供关于转录本方向性的信息。

●   对于需要精确表达方向性的分析不够适用。

应用场景：

●   常规的基因表达分析，不需要考虑转录本方向性的情况。

●   研究整体的基因表达模式和水平。

●   资源有限或对转录本方向性要求不高的研究。

图2 链特异性文库建库原理示意图

链特异性建库和非链特异性建库的选择取决于研究的具体需求。如果需要详细了解转录本的方向性和剪接事件，链特异性建库是更好的选择。而对于一般的基因表达分析，非链特异性建库则更加经济和简便。在实验设计时，研究者应根据研究目的和预算来选择合适的建库策略。

经过小编的介绍，相信大家已经对RNA建库技术有了一定的了解，目前RNA建库技术在多个领域得到广泛应用，全式金生物作为国产生物试剂原料供应商，深耕分子生物学领域多年，始终坚持自主创新，为客户提供优质的产品和服务。我们提供的链特异性和非链特异性RNA建库试剂盒，建库效率高，测序数据质量好，适配Illumina和MGI两大测序平台，充分满足客户的需求。搭配mRNA捕获、rRNA去除等产品，助力客户转录组学研究。

相关产品推荐

mRNA捕获

MagicPure^® mRNA Kit (EC511)

产品特点：

• 操作简单。

• 提取mRNA 得率高，纯度高。

• 适用于磁棒式高通量核酸提取仪。

rRNA去除

TransNGS^® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (KD101) 

产品特点：

• 可有效去除人/ 小鼠/ 大鼠高达99% 的ribosomal RNA。

• 提供Control qPCR Primer Sets，检测去除前后ribosomal RNA 和非ribosomal RNA 含量的变化。

RNA建库

快速RNA文库构建产品

TransNGS^® Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina^® (KP701)

TransNGS^® Fast RNA-Seq Library Prep Kit for MGI^® (KP801)

产品特点：

• 文库产量高。

• 文库转化率高：对于完整性不佳的RNA（RIN ≥ 3）也能有较好的建库效果。

• 操作安全：在链特异性反转录组分中无放线菌素D 存在，无需避光，低毒，无气味。

• 片段化条件宽泛：不同的片段化条件，均能得到较为一致的结果。

• 适用于多物种：适用于动物、植物、微生物的RNA 建库。

• 兼容性好：适配多种RNA 前期处理方式，如mRNA 捕获与rRNA 去除。

    除了常规的建库方法外，RNA建库还有一些特殊的应用场景。比如，对于微量样本建库（如很少量的细胞甚至是单细胞）经常采用Smart-seq2技术，该方法能够生成全长cDNA，提供更全面的转录本信息。此外，靶向捕获建库可以针对特定基因或转录本进行富集，从而获取高覆盖度的测序数据。

相关产品信息

产品分类	产品名称	目录号	规格
RNA建库	TransNGS® Fast RNA-Seq Library Prep Kit for Illumina®	KP701	12/96 rxns
	TransNGS® Fast RNA-Seq Library Prep Kit for MGI®	KP801	12/96 rxns
单细胞全长cDNA&全长转录组扩增	TransNGS® Single Cell Full Length cDNA Synthesis & Amplification Kit	KC901	12/24/96 rxns
	TransNGS® Whole Transcriptome Amplification Kit	KC921	12/96 rxns
mRNA捕获	MagicPure ® mRNA Kit	EC511	24/96 rxns
rRNA去除	TransNGS® rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)	KD101	12/96 rxns
双链接头	TransNGS® Index Primers (384) Kit for Illumina®	KI241	96/384 rxns
	TransNGS® UDI Primers (96) Kit for Illumina®	KI251	192/384 rxns
文库纯化/分选	MagicPure® Size Selection DNA Beads	EC401	5/60/450 mL